検査と技術50巻6号

2022年06月発行

ワンポイントアドバイス

リアルタイムPCRに用いられるクエンチャーの種類と使い分け

著者： 松田和之¹²

所属機関： ¹信州大学学術研究院保健学系 ²信州大学医学部保健学科検査技術科学専攻（生体情報検査学領域）

ページ範囲：P.638 - P.640

はじめに

　新型コロナウイルス遺伝子検査にも応用されている反応がリアルタイムPCR（polymerase chain reaction）である．リアルタイムPCRの手法の1つがポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性（5’末端から3’末端の方向にホスホジエステル結合を加水分解）を利用した加水分解プローブ法である^1）．これは，蛍光物質とクエンチャーで標識したdual-labeledプローブを用いた方法であり，いわゆるTaqManプローブ法とも呼ばれる．プローブの両末端に標識された蛍光物質とクエンチャーの間での蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer：FRET）により，加水分解されていないプローブでは蛍光物質からの蛍光が抑制（クエンチング）され，プローブが加水分解されるとFRETが起こらず，蛍光物質からの蛍光が検出される^2，3）．

参考文献

1）Holland PM, Abramson RD, Watson R, et al : Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A　88：7276-7280，1991

2）Lee LG, Connell CR, Bloch W : Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Res　21：3761-3766，1993

3）Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J, et al : Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl　4：357-362，1995

4）Cardullo RA, Agrawal S, Flores C, et al : Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Proc Natl Acad Sci U S A　85：8790-8794，1988

5）Kutyavin IV, Afonina IA, Mills A, et al : 3’-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res　28：655-661，2000